前言：
以前在實驗室跑電泳時，雖然聽過有軟體可以計算出，在膠體電泳之後目標片段的距離，但我一直没有親自了解過，一是因為用不到，二則是因為用不到，三還是因為用不到。直到 PTT 上有網友詢問使用 MolWt 巨集 (Macros) 時發生問題的解法後，才想試著使用看看。由於該巨集有附說明，因此可以按步驟一步一步來。但問題也就發生在明明按著步驟來，卻無法得到結果而卡關。後來，研究了一個晚上之後，才試出了解決方法。不過，這個解決方法可能並不適用於其他操作環境，使用時得稍稍微調一下。而經過和 PTT 網友的討論發現，他的問題和我的問題也不盡相同，但是可以相互參照調整。
以下，便試著按照說明文件的步驟一一來進行，並附上可能碰到的問題和可行的解決方案。因為整個操作步驟其實很簡單，只是說明上複雜囉唆了些。下文中是以 DNA 電泳為例，但是拿 protein 電泳的圖來分析也是可行的。
步驟：
I.準備
要準備好軟體 ImageJ、欲分析的膠體電泳圖檔案以及 ImageJ 的巨集，同時也是本文的主角，MolWt。
ImageJ 目前最新版本是 1.49s，可以從 ImageJ 的官方網站 (http://imagej.nih.gov/ij/) 下載。但網站給的似乎只到 1.48 版；我是使用 ImageJ 的檢查更新並自動下載安裝功能，所以目前才會使用到 1.49s 版。ImageJ 在各平台有版本差異，安裝時需要注意；其中也有跨平台版本可用；它需要 Java 才能運行。下圖是我的使用環境：
Mac OS X (10.10.3 Yosemite)
Java 1.6.0_65 (64-bit)
ImageJ 1.49s
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| ImageJ 版本 |
PTT 網友的操作環境是 Windows 7 (64-bit)，ImageJ 版本為 1.48v。後來改升到 1.49s 並按照操作說明進行之後，之前碰到的問題似乎都解決了。
MolWt 似乎是某家德國電泳和顯像儀器廠商所寫下的 ImageJ 巨集，目前並未被收錄在 ImageJ 的預設巨集中，也未收錄在 ImageJ 官網上的的巨集列表裡。可以從廠商的網站 (http://www.phase-hl.com/imagej.htm) 下載。這網站非常陽春，別被嚇到了。另外，巨集的說明文件也最好一併下載了，是PDF (http://www.phase-hl.com/ImageJ/MolWt-Macros.pdf) 檔。
II.安裝巨集
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| ImageJ 的 folders |
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| ImageJ/plugins/Analyze/ |
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| Plugins 安裝 |
這一個巨集的反安裝，我是手動從 ImageJ 程式底下的資料夾裡移除，才會在重開啟程式後看到作用。不曉得有没有更方便的方法。
在開始之前，我得聲明以下的步驟是我和 PTT 網友各自胡亂研究後的結果。基本上就是按照說明文件上的指示操作，待遇見問題時再行更動測試可行性。不保證在不同環境下能成功。III.操作解說
- 首先，以純文字編輯器準備一份純文字檔。只寫下 marker 的 basepair number，一行只能有一個數值，不要加單位或其他資訊，可以不按順序，存檔時以 txt 為副檔名。最好是將所有 marker 片段的數值都填上。以下是以 100 bps DNA marker 為例：
Marker - 從 ImageJ 打開要分析的圖檔。此處是以一份 2% agarose gel 分析 312 bps PCR product(s) 的圖檔為例。經過測試，到現在為止，無論是 JPG、PNG 或 TIFF 檔，都能正常使用。
2% Agarose Gel 電泳圖 - 框選 Marker，按下 command+1（在 Windows 下應該是 control+1），移動框框到欲分析的片段處，按下 command+2（control+2）；繼續移動框框，同樣按下 command+2（control+2），直到要分析的片段都選完了。
框選 marker 和欲分析的 lanes - 使用 Gel Analysis 功能中的 Plot Lanes（快捷鍵是 command+3/control+3）：
Gel analysis 得到一分圖檔：
Plot of Electrophoresis - (Marker) 圖有三個，從上到下分別對映到 DNA marker 和 lanes 2 & 3 的 DNA 片段。圖的最上方是 DNA marker 在背景下的 peaks 和相對於框選範圍的位置，下方則是 lanes 2 和 lane 3，圖的視窗可以下拉（scroll down），以顯示出其他框選位的圖。
因為 DNA 電泳膠圖是黑底白片段，所以 ImageJ 畫出來的圖，各個波峰都是向下。如果看得不習慣，可以事先反轉圖檔的顏色，或是利用 ImageJ 來反轉顏色也可以；反轉之後要存檔，不然顯示的波峰依然會往下。另外，DNA 電泳照相設備所得到的圖，預設中都是灰階的。如果不是灰階圖，則必須先將圖檔改成灰階模式。ImageJ 中也可以轉換顏色模式。 - 依據作者說明，將原檔案 MolWt.txt 安裝進 ImageJ 之後，分析時只要點選其中的分項或快捷鍵就可以使用。但不幸的是，在我的操作環境中，這方法並不可行。每一次點選 macro 中的 MolWt，它只會做一件事，就是『Open MW File』，要求我打開先前準備好的 marker 純文字檔案，就算已經打開過了，它還是一再地要我先讀取 marker 檔。我曾不死心地重新開啟 ImageJ、或移除並重新安裝 MolWt、或重新登入使用者、或重開機器……一點用都没有，它根本就不會自動形成這個巨集的四個操作功能。還有就是操作的快捷鍵，在我的環境中也無效或是另有他用，這應該是相衝突了；反正我平常也不用 ImageJ 的快捷鍵，所以也還好。 後來好奇地在參考 ImageJ 程式底下其他 macros 的內容之後，發現很多 macros 的內容結構都很像。在打開作者的 MolWt.txt 檔之後，裡面可以看到這巨集的四個組成：
MolWt.txt 的內容
- Open MW File
- Select Reference Bands
- Calculate Regression Line
- Estimate Unknown MW
出於死馬當活馬醫的心情，我就將原始檔 MolWt 的四個部分，分別剪貼成新的 txt 檔案並重新命名，最後再一個個地安裝進 ImageJ。名稱最好就是那四個 macro names，然後分別安裝到 ImageJ——在我的環境中，依然是路徑 Plugins→Install…才有用。
而PTT 網友則是曾經碰到過安裝完並重開啟 ImageJ 之後，之前安裝過的就又不見了的情況；或是碰到過安裝了一個，待準備要安裝下一個的時候，前一個又不見了的情形；還有，原本可以用的快捷鍵，之後不曉得怎麼一回事就又不能使用的狀況。
- 使用 macro『Open MW File』功能，打開 marker 的純文字檔，它會自動形成一份 log 檔待用。作者強調過，在這個步驟進行以前，除了 ImageJ 主程式的視窗、圖檔視窗和分析的 plot 圖之外，最好不要有其他的視窗存在，否則會算不出回歸線，自然也算不出目標片段的大小了（未知片段上會顯示 NaN）。
References log - 使用點選工具 Point，依序在每個波峰的尖端點一下，出現圓點之後，以 macro 『Select Reference Bands』功能選取相應 marker 片段的數值。只能點一個波峰，選一個數值之後，再點下一個波峰，點選相應數值，一直到點選完畢。在點選下一片段之後，前一個圓點就會變成一條豎立的直線，表示數值標定完畢。
Point out the peaks 這一步，只能使用 single point，multipoint 無效，macro 只會認 multiport 所點選的最後一個點，以等著下指令。我不曉得有没有辦法修改 macro 檔案使得 multipoint 可以運作。我自己不懂怎麼寫 script，不過 ImageJ 官網上有教人怎麼寫巨集，有興趣的可以自行研究。 - 點選完畢之後，以 macro 『Calculate the Regression Line』計算出回歸線值。基本上，回歸線的計算是只要有兩個以上的點就可以了，但是電泳的結果，從起點開始計算泳動距離，要取自然對數以在平面的對數座標上畫直線；若只給兩、三個點，則回歸線的誤差值會太大，要想計算某未知泳動片段的正確距離（分子量或鹼基對）就比較難。所以，要是 marker 片段點得夠多夠精準，算出來的回歸線，其 corr. 係數會越接近 -1，則計算未知片段的大小，結果會越精確。PTT 的網友，曾經碰到過 ImageJ 並未幫他算出回歸線的情況，於是只好將 result 貼上 Microsoft Office 的 Excel，用內建公式算出來——親手套用公式拿紙筆算也是可以啦，但是，何必呢。
回歸線的計算和求未知片段大小 - 計算出了回歸線，就可以在未知片段的 plotted figure 上用 point tool 點一下未知片段的波峰，然後以 macro『Estimate Unknown MW』功能來算出未知片段的大小。
事實上，所有步驟一切嚴格按照操作說明來進行，應該就會没問題，像是按順序一步步來，不該先出現的視窗或操作，就不要先進行。這也是我 PTT 網友相互討論出來的結論，更是巨集作者在操作說明中強調過了的。如果 ImageJ 現有版本有問題，可以升級到最新的 1.49s 或是作者使用過的 1.34 版 (Windows)。
在說明書最後，巨集的作者也說了，可以直接在欲分析的電泳圖上點選 marker 並註記相應大小，不需要 plot 圖，就能計算相應的回歸線並求取未知片段的大小。但我没試，我認為自己看電泳圖標定，不會比在 plot 圖上標波峰來得準確。
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